Segurança de Suplementos Alimentares à base de plantas

Instituições participantes:

Neste projeto estão envolvidas 2 instituições:

- Instituto de Ciências e Tecnologias Agrárias e Agroalimentares - Porto (ICETA-Porto/UP), envolvendo as unidades de investigação REQUIMTE/Faculdade de Farmácia da UP e REQUIMTE/Instituto Superior de Engenharia do Porto

- Instituto Politécnico de Bragança

Enquadramento

Na última década, as plantas medicinais e produtos derivados tornaram-se cada vez mais disponíveis no mercado da UE como componentes de formulações vendidas como suplementos alimentares. Estes são normalmente rotulados como sendo produtos naturais com uma variedade de alegações no que respeita a possíveis benefícios para a saúde dos consumidores. Os suplementos alimentares são legalmente considerados alimentos ao abrigo da Diretiva 2002/46/CE, pelo que não precisam de autorização para a colocação no mercado, recaindo a responsabilidade legal pela sua segurança nos operadores do sector. Assim, várias fitopreparações têm sido comercializadas como suplementos alimentares à base de plantas (PFS, Plant Food Supplements), dispensando o cumprimento de requisitos e procedimentos de registo oficial necessários para serem reconhecidos como Medicamentos à base de plantas (Traditional Herbal Medicines) segundo a Directiva 2004/24/EC. Sendo considerados alimentos, os PFS não estão sob a alçada da Agência Europeia de Medicamentos (EMA), mas da Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos (EFSA), que já expressou receios sobre sua segurança.

Entre os vários problemas que podem afetar a segurança dos PFS, as adulterações representam um problema crescente de saúde pública. Este tipo de prática compreende vários aspetos, sendo os principais a adição de substâncias ilegais e a troca intencional/identificação errada do material botânico.

Um dos tipos de PFS mais populares são os produtos para perda de peso uma vez que diversos consumidores procuram soluções fáceis que não incluam mudanças de dieta e estilos de vida. Contudo, com o intuito de aumentar as vendas, fabricantes inescrupulosos podem adicionar fármacos a estes produtos com vista à obtenção de efeitos mais rápidos e eficazes. Recentemente, diferentes anoréticos banidos do mercado, tais como a sibutramina, têm sido detetados em PFS vendidos nos EUA. Além de supressores de apetite, várias outras substâncias podem ser adicionadas para aumentar/coadjuvar o efeito de perda de peso.

Outra possível adulteração de PFS compreende a troca de plantas medicinais de elevado preço por outras espécies de menor valor económico e/ou a adição intencional de material vegetal sem interesse medicinal para aumentar o volume final do produto. Em ambos os casos, a integridade e segurança do suplemento alimentar é comprometida pela introdução de fitoquímicos desconhecidos provenientes das plantas não rotuladas, tendo já sido descrita a ocorrência de problemas para a saúde dos consumidores resultantes de plantas não declaradas em PFS.

Projeto e Objetivos

Dado este cenário, existe a necessidade de desenvolver metodologias eficazes, sensíveis e rigorosas que permitam a identificação de adulterações deste tipo de produtos, quer pela rápida identificação e quantificação de fármacos ilegalmente adicionados e potencialmente prejudiciais, quer pela autenticação do material botânico em PFS.

Para isso, pretendeu-se desenvolver e validar uma metodologia baseada na cromatografia líquida de ultra alta eficiência com deteção por espetrometria de massa (UHPLC-MS/MS) para detetar a adição fraudulenta de substâncias farmacologicamente ativas nos PFS. A metodologia desenvolvida será ainda aplicada a PFS para perda de peso comercializados em Portugal, resultando na obtenção de dados que permitam inferir sobre uma maior necessidade do seu controlo.

No que respeita à autenticação das plantas medicinais nestes produtos, até à data, a maioria das metodologias utilizadas tem-se baseado na análise cromatográfica. No entanto, sabe-se que a composição química das plantas é muito variável, tornando o perfil químico numa opção inadequada. Pelo contrário, as técnicas de DNA-fingerprinting permitem uma identificação inequívoca, não sendo os seus resultados afetados com a região, clima, parte da planta, etc. Para avaliar a adulteração com material vegetal em PFS, a equipa responsável pelo projeto trabalhou no desenvolvimento de uma técnica baseada em DNA-barcoding, tendo espécies de hipericão (Hypericum spp.) como caso de estudo.

As questões de adulteração referidas nos PFS representam desafios consideráveis para a comunidade científica e saúde pública em geral, que precisam ser tratados de forma adequada. Para alcançar este objetivo, o projeto proposto reuniu uma equipa multidisciplinar com know-how complementar e instrumentação necessária à realização das tarefas.

Principais resultados

> Desenvolvimento de dois marcadores moleculares (DNA mini-barcodes) para a identificação específica de 2 espécies de Hipericão: Hypericum perforatum e Hypericum androsaemum - Foram selecionados 2 loci como potenciais DNA barcodes, nomeadamente internal transcribed spacer 1 (ITS1) e maturase K (matK), que permitiram o desenvolvimento e otimização de técnicas de PCR qualitativa e PCR em tempo real. Nesta fase, utilizou-se uma abordagem inovadora – a análise por high resolution melting (HRM) – acoplada à técnica de PCR em tempo real como ferramenta confirmatória da espécie.

> Aplicação da metodologia desenvolvida a suplementos alimentares contendo hipericão. Inicialmente foram testados diferentes métodos para a extração de ADN a partir de suplementos alimentares, nomeadamente baseados em métodos clássicos (CTAB) ou em kits comerciais (NucleoSpin Plant II, DNeasy Plant Mini Kit). Posteriormente, os extratos foram testados para a identificação de hipericão em suplementos alimentares. Num total de 11 suplementos com rotulagem contendo Hypericum perforatum, 6 amplificaram positivamente a espécie.

> Avaliação da interferência de excipientes farmacêuticos na extração de ADN de amostras de suplementos alimentares. Uma das condicionantes associadas à extração de ADN amplificável de suplementos alimentares pareceu relacionar-se com a presença de certos excipientes na sua formulação, os quais podem adsorver o ADN à sua superfície, impedindo a sua extração de suplementos alimentares. Estes dados foram comprovados ao longo do projeto, estando ainda a ser tentadas novas estratégias para permitir a libertação do ADN em amostras de suplementos contendo os referidos excipientes.

Figura – Curvas de amplificação obtidas por PCR em tempo real para amostras de PFS contendo diferentes excipientes farmacêuticos às quais foi adicionado 50 ng de ADN de milho (padrão interno)

> Desenvolvimento de marcadores moleculares para a diferenciação de Cynara scolymus e Sylibum marianum - Para além do caso de estudo sugerido neste projeto (Hypericum spp.), foram desenvolvidas técnicas para avaliação de outras plantas de interesse, nomeadamente a alcachofra (C. scolymus) e cardo mariano (S. marianum) pelo seu uso em suplementos alimentares para emagrecimento.

> Desenvolvimento de uma metodologia com base em HPLC-DAD-FL para deteção e quantificação de 18 fármacos adulterantes em PFS. A metodologia desenvolvida e validada permite a análise de compostos pertencentes a diferentes classes terapêuticas (supressores de apetite, estimulantes, diuréticos, laxantes, antidepressivos e ansiolíticos), e incluiu a otimização da extração prévia pela técnica de QuEChERS.

Trabalho em curso:

> Desenvolvimento de uma metodologia com base em UHPLC-MS/MS para deteção e quantificação de 24 fármacos adulterantes em PFS. A metodologia analítica permitirá a determinação de 24 compostos pertencentes às diferentes classes terapêuticas indicadas anteriormente, funcionando como técnica de confirmação e permitindo atingir limites de deteção significativamente inferiores.

> Avaliação da presença de substâncias ilícitas/proibidas em suplementos alimentares por métodos cromatográficos (UHPLC-MS/MS). Aplicação da metodologia desenvolvida à análise de amostras de PFS.

> Desenvolvimento de novas estratégias para a otimização da extração de ADN a partir de amostras de suplementos alimentares contendo excipientes/interferentes de extração.

> Aplicação das metodologias desenvolvidas para a avaliação de alcachofra e/ou cardo mariano em suplementos alimentares para a perda de peso.

Apoio

O projeto foi apoiado pelo FEDER (Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional), no âmbito do COMPETE - Programa Operacional Factores de Competitividade e por fundos nacionais, através da FCT - Fundação para a Ciência e Tecnologia com um investimento elegível de cerca de 49 mil euros, correspondendo a um incentivo FEDER de aproximadamente 42 mil euros.

Testemunho

Segundo Joana Amaral, investigadora responsável pelo projeto, é importante referir que a realização deste projeto só foi possível com o financiamento por Fundos FEDER através do Programa Operacional Factores de Competitividade – COMPETE e por Fundos Nacionais através da FCT – Fundacão para a Ciência e a Tecnologia, o qual permitiu reunir as condições necessárias ao desenvolvimento do trabalho de investigação e a divulgação dos resultados em conferências da especialidade.